干細(xì)胞的出現(xiàn)極大地推動了再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展,，涵蓋了基于細(xì)胞的高通量藥物篩選,、細(xì)胞移植和器官移植等應(yīng)用領(lǐng)域，展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景,。干細(xì)胞行業(yè),，尤其是間充質(zhì)干細(xì)胞治療的快速發(fā)展，方興未艾,。
隨著對間充質(zhì)干細(xì)胞治療機(jī)理的深入研究,，研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞通過外泌體來發(fā)揮治療作用,，從而推動了干細(xì)胞外泌體的研究和發(fā)展。
2013年,，諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎授予了三位科學(xué)家，表彰其在細(xì)胞間囊泡運(yùn)輸調(diào)控機(jī)制領(lǐng)域作出的突出貢獻(xiàn),。諾獎的肯定,，使得胞外囊泡及其生理學(xué)功能成為熱點(diǎn)，得到廣泛研究,。
不同類型的細(xì)胞均可通過出芽方式釋放各種各樣的囊泡（如外泌體,、微囊泡、凋亡小體）到細(xì)胞外,，囊泡大小從40nm到毫米不等,，統(tǒng)稱為胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EV）,。
EV的外層為磷脂膜,，內(nèi)層由特定類型的蛋白質(zhì)組成，包括酶,、生長因子,、受體、細(xì)胞因子,、脂質(zhì),、RNA和代謝物。直徑30～150nm的胞外囊泡,，即為外泌體（exosome）,。
早在20世紀(jì)60年代，EV的生理特性得到闡述,，EV可在細(xì)胞,、器官之間，甚至有機(jī)體之間傳遞信息,，在血液,、尿液、腦脊液,、母乳和唾液等體液中均能檢測到,。具有運(yùn)輸和轉(zhuǎn)移生物活性分子，介導(dǎo)靶向細(xì)胞間信號傳遞,、遺傳信息的功能性轉(zhuǎn)移等作用,。
間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）分泌大量的EV，EV內(nèi)容物包括蛋白和RNA（＞80%）,，以及一些小RNA,，其中miRNAs約44%、tRNA約47%,。MSC通過EV與其他細(xì)胞實(shí)現(xiàn)信息交流,，發(fā)揮治療作用。MSC-EV可表達(dá)MSC表型標(biāo)記,，如CD29,、CD73、CD44和CD105,。
已在MSC-EV中發(fā)現(xiàn)850多個獨(dú)特的基因產(chǎn)物和160多個miRNAs,。
MSC-EV已在幾種不同類型的疾病中顯示出令人鼓舞的治療效果，包括腎損傷,、心臟損傷,、腦損傷和肝肺損傷等。主要機(jī)制可能是MSC-EV介導(dǎo)了MSC的旁分泌/自分泌機(jī)制,。
急慢性腎損傷方面,，MSC-EV中的生長因子mRNA可轉(zhuǎn)移到順鉑損傷的近端腎小管上皮細(xì)胞（PTEC），促進(jìn)PTEC增殖,；IGF-1R的mRNA通過體外水平轉(zhuǎn)移到腎小管上皮細(xì)胞,，增強(qiáng)了腎小管細(xì)胞對局部產(chǎn)生的IGF-1的敏感性。如果骨髓MSC-EV的miRNA耗竭,，則在急性腎損傷中MSC-EV的再生修復(fù)能力顯著降低,，提示在急性腎損傷恢復(fù)中，miRNAs起著關(guān)鍵作用,。
心肌梗死方面,，體外擴(kuò)增的MSC培養(yǎng)上清液已成功用于縮小小鼠心肌梗死范圍。MSC上清液的促再生活性被證明為EV組分,，去除EV后則沒有作用效果,。MSC-EV介導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)作用可減輕大腸桿菌內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷和低氧誘導(dǎo)的肺動脈高壓。MSC-EV還展示了減輕藥物誘導(dǎo)肝損傷和肝纖維化的能力,。
MSC-EV可直接促進(jìn)血管生成,。在大鼠模型中，MSCEV可顯著改善后肢缺血灌注,，加速皮膚燒傷后的再上皮化，并提高同種異體皮膚移植物的存活率,。在中風(fēng)模型缺血性閉塞后,，MSC-EV給藥可促進(jìn)功能恢復(fù)和新生血管，顯著改善卒中誘導(dǎo)后的功能，但是MSC組和MSC-EV組沒有明顯的療效差異,。
在綿羊模型中,，應(yīng)用MSC-EV可觀察到大腦缺氧損傷的改善。miRNA-133b似乎與MSC-EV介導(dǎo)的大鼠缺血性卒中后的功能恢復(fù)有關(guān),，而miRNA-22似乎與MSC-EV介導(dǎo)的缺血性心臟病心肌細(xì)胞的抗凋亡作用有關(guān),。
因此，MSC-EV可用于中風(fēng)的治療,，作為干細(xì)胞輸注的替代方法,，改善神經(jīng)預(yù)后，增加血管與神經(jīng)生成,。
MSC-EV對多種類型的免疫細(xì)胞均具有免疫調(diào)節(jié)作用,，包括樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞,、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,。在關(guān)節(jié)炎模型中，MSC-EV體內(nèi)炎癥抑制作用比MSC更強(qiáng),。
MSC-EV的免疫調(diào)節(jié)作用包括：1）通過miRNAs介導(dǎo)DC的免疫調(diào)節(jié),；2）通過增強(qiáng)M2巨噬細(xì)胞極化和間接驅(qū)動T細(xì)胞誘導(dǎo)發(fā)揮免疫抑制作用；3）抑制健康供者和GvHD患者NK細(xì)胞和其他外周白細(xì)胞的激活,；4）在體外與PBMC共培養(yǎng)時抑制T細(xì)胞的激活,，促進(jìn)調(diào)節(jié)性CD4+、CD25+,、FOXp3+,、T細(xì)胞的增殖；5）高度表達(dá)GVHD改善相關(guān)的多種可溶性因子,，靜脈輸注MSC-EV可抑制CD4+T和CD8+T細(xì)胞的活化和浸潤,，從而延長GVHD小鼠模型的存活時間，并減少多個器官的病理損傷,。
在小鼠體內(nèi)的生物發(fā)光和熒光介導(dǎo)的斷層成像顯示，EV靜脈注射主要分布在脾,、肝,、肺和腎，30分鐘內(nèi)在腦,、心臟和肌肉中可檢測到EV,，60分鐘后尿液中可檢測到EV。
已經(jīng)觀察到,，MSC-EV的促腫瘤和抗腫瘤作用,，目前尚無給藥的任何副作用報(bào)道，可以認(rèn)為MSC-EV給藥基本上安全，且由于EV不能自我復(fù)制,，無內(nèi)源性腫瘤形成潛力,。
2011年,，進(jìn)行了第一次有記錄的臨床MSC-EV給藥,，MSC-EV以遞增的劑量應(yīng)用于1例類固醇耐藥的GVHD患者，4×107個MSC培養(yǎng)上清液分離的MSC-EV（1.3-3.5×10*10個顆?；?.5～1.6mg）被定義為1個單位,，每隔2~3天靜脈注射一次，共2周,，總共接受4個單位,，GVHD癥狀顯著下降，每日類固醇劑量可從125mg減少到30mg,，治療后穩(wěn)定了5個月,，MSC-EV給藥耐受性良好，未觀察到副作用,。
對20例慢性腎臟病患者進(jìn)行的Ⅱ/Ⅲ期臨床研究表明,，臍帶MSC-EV（輸注2次，相隔1周）可改善腎小球?yàn)V過率,、血肌酐水平,、血尿素和尿白蛋白肌酐比值，伴隨著TGF-β1,、IL-10水平明顯升高和血漿TNF-α水平顯著下降,，沒任何副作用。
MSC-EV用于8例患者牙槽骨再生研究發(fā)現(xiàn),，無不良反應(yīng),，放射學(xué)評估顯示所有病例均有早期骨形成，注射部位的炎性淋巴細(xì)胞浸潤很少,，研究證明MSC-EV在骨再生方面具有較大的潛力,。
對7例長期存在大型特發(fā)性難治性黃斑裂孔患者，年齡51～75歲,，行玻璃體切除,、內(nèi)界膜剝離、MSC（2例）或MSC-EV（5例）玻璃體腔內(nèi)注射,；5例MH閉合術(shù)患者最佳矯正視力提高,，其中1例接受MSC治療的患者在視網(wǎng)膜表面觀察到纖維膜，1例接受較大劑量MSC-EV的患者出現(xiàn)炎癥反應(yīng),。
MSC-EV具有免疫調(diào)節(jié)活性并促進(jìn)再生過程,，其方式顯然與MSC相當(dāng)。因此,，基于EV的無細(xì)胞療法，為多種疾病提供了一種基于干細(xì)胞治療的有前途的替代方案,。與細(xì)胞療法相比,，EV療法具有一些優(yōu)勢，但由于該領(lǐng)域的新穎性,，其臨床分級生產(chǎn),、質(zhì)量保證和應(yīng)用缺乏國際公認(rèn)的指南。
改變MSC的培養(yǎng)環(huán)境,，用不同的外界刺激預(yù)處理,，這不僅可以影響EV的產(chǎn)量，還可以調(diào)節(jié)它們的成分,。例如,，中風(fēng)患者血清培養(yǎng)或缺血腦組織提取液處理，都可激活MSC釋放更多的EV,。MSC培養(yǎng)時給予炎癥刺激,，將增強(qiáng)抗炎特性的EV釋放。
與傳統(tǒng)的2D培養(yǎng)相比,，微載體3D培養(yǎng)中,，MSC分泌更高的EV，并降低整合素的表達(dá),。3D培養(yǎng)在MSC-EV生產(chǎn)中可能優(yōu)勢,，包括：1）需要大量的培養(yǎng)基才能獲得大量臨床使用的EV；2）持續(xù)的培養(yǎng)基灌流,，可避免代謝副產(chǎn)物的積累,；3）控制進(jìn)出生物反應(yīng)器的培養(yǎng)基流量可連續(xù)產(chǎn)出。
超速離心是收集EV最常用,、最常規(guī)的方法,。市面上可買到一種快速、簡單的試劑盒,，其分離方法相對粗糙,、易引起可溶性蛋白污染。
超速離心方法可獲得純EV用于科研,，但在臨床上耗時長,，不適合大規(guī)模生產(chǎn)。超速離心聚集囊泡,，易于分離到可溶性因子和蛋白質(zhì),?；诿芏忍荻鹊姆蛛xEV，效率最高,。一些新興的技術(shù),，如尺寸排除色譜、聲學(xué)分離,、納米捕捉器,、流場流動分級，都有可能從不同的樣品基質(zhì)中分離出EV,。
EV的質(zhì)量保證是后續(xù)治療的基礎(chǔ),。雖然有研究表明，MSC-EV發(fā)揮了治療作用,，且無副作用,，但必須建立適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，以確保所產(chǎn)生的EV產(chǎn)品的質(zhì)量,、安全性和有效性得到保障,。如EV應(yīng)儲存在等滲緩沖液中，以防止儲存和凍融循環(huán)期間的pH變化,。
干細(xì)胞外泌體的深入研究有助于闡述干細(xì)胞治療的精準(zhǔn)機(jī)制，而且干細(xì)胞外泌體有可能在治療應(yīng)用領(lǐng)域替代干細(xì)胞,。干細(xì)胞外泌體（特指MSC-EV）是一個研究和應(yīng)用都值得期待的好方向,，但是需要腳踏實(shí)地地去做些工作。
因此,，為了開發(fā)基于EV的藥物,，至少需要在以下方面產(chǎn)生突破：1）適用于大規(guī)模制備、純化和儲存的分離方案,；2）量化,、分子和物理表征的標(biāo)準(zhǔn)化方案；3）明確的臨床使用質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn),。
本文來源于《醫(yī)學(xué)參考報(bào)》干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)頻道2020-04期第4版文章